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Sep 06, 2023

Progettazione de novo di biosensori proteici modulari e sintonizzabili

Nature volume 591, pages

Natura volume 591, pagine 482–487 (2021)Citare questo articolo

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Gli interruttori proteici presenti in natura sono stati riproposti per lo sviluppo di biosensori e reporter per applicazioni cellulari e cliniche1. Tuttavia, il numero di tali interruttori è limitato e riprogettarli è impegnativo. Qui mostriamo che una classe generale di biosensori basati su proteine ​​può essere creata invertendo il flusso di informazioni attraverso interruttori proteici progettati de novo in cui il legame di una chiave peptidica attiva output biologici di interesse2. I sensori progettati sono dispositivi molecolari modulari con uno stato buio chiuso e uno stato luminescente aperto; il legame dell’analita determina il passaggio dallo stato chiuso a quello aperto. Poiché il sensore si basa sull'accoppiamento termodinamico del legame dell'analita con l'attivazione del sensore, è richiesto un solo dominio di legame del target, il che semplifica la progettazione del sensore e consente la lettura diretta nella soluzione. Creiamo biosensori in grado di rilevare in modo sensibile la proteina anti-apoptosi BCL-2, il dominio IgG1 Fc, il recettore HER2 e la neurotossina botulinica B, nonché biosensori per la troponina cardiaca I e un anticorpo anti-virus dell'epatite B con elevata sensibilità necessari per rilevare queste molecole clinicamente. Data la necessità di strumenti diagnostici per monitorare la sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2)3, abbiamo utilizzato questo approccio per progettare sensori per la proteina spike SARS-CoV-2 e anticorpi contro le proteine ​​di membrana e nucleocapside. Il primo, che incorpora un legante del dominio legante il recettore del picco (RBD) progettato de novo, ha un limite di rilevamento di 15 pM e un segnale di luminescenza 50 volte superiore al livello di fondo. La modularità e la sensibilità della piattaforma dovrebbero consentire la rapida costruzione di sensori per un'ampia gamma di analiti ed evidenziare il potere della progettazione proteica de novo per creare sistemi proteici multistato con funzioni nuove e utili.

I biosensori a base proteica svolgono un ruolo importante nella biologia sintetica e nelle applicazioni cliniche, ma la progettazione dei biosensori è stata finora per lo più limitata alla riprogettazione delle proteine ​​naturali1. Trovare specifici domini leganti l'analita che subiscono cambiamenti conformazionali dopo il legame è impegnativo e, anche quando disponibili, sono generalmente necessari ampi sforzi di ingegneria proteica per accoppiarli efficacemente a un dominio reporter5,6. È quindi auspicabile costruire piattaforme di biosensori modulari che possano essere facilmente riproposte per rilevare diversi bersagli proteici di interesse. Sono stati sviluppati sistemi modulari per rilevare anticorpi7,8,9 e piccole molecole10,11, ma i sensori proteici generali rappresentano una sfida più grande data la grande diversità di strutture proteiche, dimensioni e stati di oligomerizzazione e approcci come le piattaforme proteiche semisintetiche12,13,14 , o switch della calmodulina15,16, di solito richiedono uno screening considerevole per trovare potenziali candidati a causa della prevedibilità limitata17.

Un biosensore proteico può essere costruito da un sistema con due stati quasi isoenergetici, il cui equilibrio è modulato dall'analita rilevato. Le proprietà desiderabili in un tale sensore sono: (i) il cambiamento conformazionale innescato da un analita dovrebbe essere indipendente dai dettagli dell'analita, quindi lo stesso sistema complessivo può essere utilizzato per rilevare molti target diversi; (ii) il sistema dovrebbe essere sintonizzabile in modo che analiti con diverse energie di legame e diverse concentrazioni tipiche possano essere rilevati su un ampio intervallo dinamico; e (iii) il cambiamento conformazionale dovrebbe essere accoppiato a un output sensibile. Abbiamo ipotizzato che questi attributi potrebbero essere ottenuti invertendo il flusso di informazioni in interruttori proteici progettati de novo in cui il legame con una proteina bersaglio di interesse è controllato dalla presenza di un attuatore peptidico2. Abbiamo sviluppato un sistema costituito da due componenti proteici: in primo luogo, un "lucCage" che comprende un dominio di gabbia e un dominio di latch che contiene un motivo di legame del bersaglio e un frammento di luciferasi diviso (piccolo BiT (SmBiT) 114)18; e in secondo luogo, un "lucKey" che contiene un peptide chiave che si lega allo stato aperto di lucCage e al frammento complementare della luciferasi divisa (BiT grande (LgBit) 11S)18 (Fig. 1a). lucCage ha due stati: uno stato chiuso, in cui il dominio della gabbia si lega al fermo e occlude stericamente il motivo di legame dal legame del bersaglio e SmBiT dalla combinazione con LgBit per ricostituire l'attività della luciferasi, e uno stato aperto, in cui queste interazioni di legame sono non bloccato e lucKey può legarsi al dominio della gabbia. L'associazione di lucKey con lucCage determina la ricostituzione dell'attività luciferasica (Fig. 1a, a destra). La termodinamica del sistema è sintonizzata in modo tale che l'energia libera vincolante di lucKey a lucCage (ΔGCK) è insufficiente per superare il costo di energia libera dell'apertura di lucCage (ΔGopen) in assenza di target (ΔGopen − ΔGCK >> 0), ma in la presenza del bersaglio, l'ulteriore energia libera legante del latch al bersaglio (ΔGLT) guida l'apertura del latch e la ricostituzione della luciferasi (ΔGopen − ΔGCK − ΔGLT << 0) (Fig. 1b, c). Questo sistema soddisfa le proprietà (i) e (ii) di cui sopra, poiché è possibile ingabbiare un'ampia gamma di attività di legame e poiché l'interruttore è controllato termodinamicamente, le energie di legame di lucKey e target possono essere regolate per ottenere l'attivazione alle concentrazioni target pertinenti. Poiché lucKey e lucCage sono sempre gli stessi, il sistema è modulare: la stessa associazione molecolare può essere accoppiata al legame di molti bersagli diversi. La bioluminescenza fornisce una lettura rapida e sensibile dell'associazione lucCage-lucKey guidata dall'analita, soddisfacendo la proprietà (iii).